要使 ELISA 測定得到準確的結果，不論是定性的還是定量的，必須嚴格按照規定的方法制備試劑和實施測定。主要試劑的制備要點已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗滌液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反應終止液等，配制時不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存，使用前應觀察是否變質。蒸餾水的質量在 ELISA 中也至關重要，最好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。測定的實施中，應力求各個步驟操作的標準化，下面以板式 ELISA 為例，介紹有關注意事項。
（一）加樣
在 ELISA 中除了包被外，一般需進行 45 加樣。在定性測定中有時不強調加樣量的準確性，例如規定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規定配制。加樣時應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現氣泡。
（二）保溫
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結合物后，此時反應的溫度和時間應按規定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 板不應疊在一起。為避免蒸發，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于 20℃，ELISA 板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當時，即可終止酶反應。
（三）洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應聚，但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯待塑料對蛋白質的吸附作用是普遍性的。
因此在 ELISA 測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質，常作為助溶劑。根據脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯 20，在 ELISA 中最為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。
洗滌如不*，特別在最后一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體作用而產生干擾。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內反應液；②將洗滌液注滿板孔；③放置 2 min，略作搖動；④吸干孔內液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數一般為 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次。
（四）比色
如陰性對照顏色極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定結果，準確性決定于 ELISA 板底的平整與透明度和比色計的質量。
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