熒光定量PCR(Real-time PCR)，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
對(duì)照的目的是對(duì)檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控，因此我們按照檢測(cè)的流程對(duì)對(duì)照進(jìn)行梳理。
常規(guī)熒光定量PCR的流程是：樣品采集-運(yùn)輸-樣品處理-核酸提取-反轉(zhuǎn)錄(RNA病毒)-擴(kuò)增-結(jié)果讀取。下面看看各個(gè)環(huán)節(jié)都可以使用哪些對(duì)照？
1、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照
陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是指在相同的處理?xiàng)l件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進(jìn)行了提取和擴(kuò)增最終獲得了陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果。陰陽(yáng)性對(duì)照強(qiáng)調(diào)處理過(guò)程與樣品一致，并且有明確的預(yù)期結(jié)果。
2、擴(kuò)增對(duì)照
我們通常說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照指的是擴(kuò)增試劑盒中附帶的不需要提取的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，更準(zhǔn)確的定義應(yīng)該是擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照和擴(kuò)增陰性對(duì)照。擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照含有陽(yáng)性擴(kuò)增模板，擴(kuò)增陰性對(duì)照應(yīng)含有陰性擴(kuò)增模板(基質(zhì)核酸)。擴(kuò)增對(duì)照只能監(jiān)控每次擴(kuò)增過(guò)程中的擴(kuò)增系統(tǒng)是否正常，不能監(jiān)控采樣、提取和每份樣品的操作過(guò)程。如果是檢測(cè)RNA樣品的檢測(cè)試劑盒，其擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照使用質(zhì)粒，便無(wú)法監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。
3、內(nèi)標(biāo)(Internal Control，IC)
內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴(kuò)增，而其他的對(duì)照都是獨(dú)立擴(kuò)增。
3.1 內(nèi)參基因
通常它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。內(nèi)參基因通常是持家基因(house-keeping gene)因?yàn)槠浔磉_(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而且在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)變化很小。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內(nèi)參基因的優(yōu)點(diǎn)是與樣品中的靶基因經(jīng)歷全相同的處理程序，可以監(jiān)控采樣，運(yùn)輸，核酸提取和擴(kuò)增的全部過(guò)程。缺點(diǎn)是不同物種，不同生理狀態(tài)下，不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異。如果樣品類(lèi)型是口腔液，咽拭子等樣品，內(nèi)參基因的量很低可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立。如果檢測(cè)的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能全失效。
3.2人工內(nèi)標(biāo)
添加一種不會(huì)干擾靶序列擴(kuò)增的人工合成的內(nèi)標(biāo)。現(xiàn)在國(guó)外的診斷試劑盒大部分都會(huì)將內(nèi)標(biāo)直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴(kuò)增，但是這樣的內(nèi)標(biāo)不能監(jiān)控采樣，運(yùn)輸和核酸提取的過(guò)程。
還有另一種形式的內(nèi)標(biāo)，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標(biāo)，這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴(kuò)增的過(guò)程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監(jiān)控胞內(nèi)細(xì)菌病毒的釋放情況。
4、核酸提取對(duì)照
可以使用內(nèi)參基因，假病毒混合基質(zhì)，滅活病毒混合基質(zhì)來(lái)監(jiān)控提取到擴(kuò)增的流程。
5、反轉(zhuǎn)錄對(duì)照(RT control)
可以使用提取好的RNA內(nèi)參基因，RNA假病毒混合基質(zhì)，滅活RNA病毒混合基質(zhì)來(lái)監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄到擴(kuò)增的流程。
無(wú)反轉(zhuǎn)錄對(duì)照(no-RT control)含有除反轉(zhuǎn)錄酶以外的所有成分。
6、空白對(duì)照(Blank control)
6.1無(wú)模板空白對(duì)照
NTC是指不含有模板(陽(yáng)性模板或者陰性模板)的對(duì)照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實(shí)兩者有不同的作用。
6.2儀器空白對(duì)照
NTC是含有引物探針和反應(yīng)液主要監(jiān)控引物探針，反應(yīng)體系有沒(méi)有被污染。這里的儀器空白對(duì)照我通常使用的是空反應(yīng)管來(lái)監(jiān)控儀器有無(wú)非特異性的熒光信號(hào)。
6.3熒光染料對(duì)照
最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號(hào)在每個(gè)樣品孔會(huì)有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統(tǒng)可以根據(jù)ROX熒光染料的信號(hào)值來(lái)校準(zhǔn)每孔的熒光信號(hào)。
7、質(zhì)控品(Quality control, QC)
上述環(huán)節(jié)中使用的各種對(duì)照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產(chǎn)品，有的是實(shí)驗(yàn)室自制，所以整個(gè)的監(jiān)控過(guò)程可能存在不夠客觀和獨(dú)立。因此在實(shí)驗(yàn)室的對(duì)照設(shè)置中每次檢測(cè)都建議使用第三方質(zhì)控品，有條件的使用國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Reference material ,RM)。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確量值和計(jì)量溯源性，可以更準(zhǔn)確的評(píng)估整個(gè)試驗(yàn)流程的準(zhǔn)確度。
8、定值參考品
醫(yī)學(xué)上的定量檢測(cè)試劑盒，需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測(cè)使用。
對(duì)照的選擇：
從上文可知沒(méi)有一種對(duì)照是美的，在檢測(cè)中我們要根據(jù)自己的需求來(lái)進(jìn)行靈活選擇和搭配。建議每一次檢測(cè)時(shí)添加一個(gè)能對(duì)從提取到擴(kuò)增環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；每份檢測(cè)樣品中添加內(nèi)標(biāo)(如果樣品種類(lèi)比較多樣建議使用人工內(nèi)標(biāo)，如果樣品類(lèi)型為相對(duì)固定的動(dòng)物組織建議使用內(nèi)參基因)；擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增陰性對(duì)照，無(wú)模板對(duì)照和ROX對(duì)照。有條件的添加臨床陽(yáng)性對(duì)照和臨床陰性對(duì)照，在懷疑提取環(huán)節(jié)或者反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)使用核酸提取對(duì)照和反轉(zhuǎn)錄對(duì)照。不定期使用儀器空白對(duì)照。
